微生物平皿法和薄膜過濾法與微生物限度檢查和無菌檢查的介紹

無菌檢查是檢查是否有活微生物存在的一種方法;,微生物限度檢查是檢查活微生物數(shù)是否超出規(guī)定限度的一種方法。由此可見兩者是有區(qū)別的。無菌檢查控制較嚴格，不允許論何活微生物存在;微生物限度檢查只要求活微生物數(shù)控制在一定限度范圍之內(nèi)，即可。

在藥品控制上，《中國藥典》2010年版規(guī)定:

無菌檢查用于注射劑、滴眼劑等藥物的檢查，并且檢查培養(yǎng)時間為14天。微生物限度檢查用于片劑、口服液等制劑的檢查，細菌培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天?？诜o藥制劑細菌數(shù)不得過100cfu/mL,或1000cfu/g;霉菌和酵母菌數(shù)不得過100cfu/m L(或)g。

相同之處，無菌檢查、微生物限度檢查勻應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的無菌室內(nèi)進行操作。

無菌檢查是說任何菌都不能存在，微生物限度檢查是說可以有非病原菌的存在但有數(shù)量的限制。

集菌儀與無菌檢查薄膜過濾器的區(qū)別

集菌儀的作用是檢驗供試品是否含菌的儀器，配套集菌培養(yǎng)器使用。主要用于注射用無菌制劑的無菌檢測，包括抗生素類及含有抑菌成份的藥品、大輸液、水針劑、滅菌醫(yī)療器具、無菌注射用水等。其檢測過程是，供試品通過進樣管道連續(xù)被注入集菌培養(yǎng)器中，利用集菌培養(yǎng)器內(nèi)形成的下壓，通過0.45微米孔徑的濾膜過濾，供試品 中可能存在的微生物被截留收集在濾膜上，通過沖洗濾膜除去供試品的抑菌成分。然后把所需培養(yǎng)基通過進樣管道直接注入集菌培養(yǎng)器中，放置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，觀察是否有長菌現(xiàn)象。廣泛適用于注射用無菌制劑的無菌檢測，包括抗生素類及含有抑菌成份的藥品、大輸液、水針劑、滅菌醫(yī)療器具、無菌注射用水等，也可用于食 品、飲料行業(yè)等微生物限度檢查。不同于集菌儀的用途是，無菌檢查薄膜過濾器，不僅符合中國藥典2015版，也是國家藥品GMP認證的儀器。其是用于微生物限度檢查的。中西藥制劑均適用。

《中國藥典》微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。

微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。

供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物無毒性。

除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30℃~35℃;霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23℃~28℃。

檢驗結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告，特殊品種可以z小包裝單位報告。

驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。

供試品檢查

計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。

按計數(shù)方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1:10、1:l02、l:103等稀釋級的供試液。

平皿法

根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注人15~20ml溫度不超過45 ℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。

陰性對照試驗

取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中.注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。

培養(yǎng)和計數(shù)

除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至7天進行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15.則兩個平板的菌落數(shù)不能相差l倍或以上。

一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù);酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下.若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。

含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。

菌數(shù)報告規(guī)則

細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù)。以z高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、lml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。

如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅z低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以<1乘以z低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。

薄膜過濾法

采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜.沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的z大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷。

取相當于每張濾膜含lg、lml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、lml或10cm2所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液lml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對照試驗

取試驗用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

培養(yǎng)和計數(shù)

培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。

菌數(shù)報告規(guī)則

以相當于1g、lml或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù);若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g、lml或10cm2供試品)，或<l乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。